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简介：对于用于癌症诊断的EV分离纯化，选择正确的方法可能是找到成功的诊断标记物与未能达到足够的特异性和敏感性之间的区别。随着qEV尺寸排阻柱提供卓越的EV纯度，您的生物标志物有更大的机会在背景噪声中脱颖而出。

        随着人口增长和老龄化，癌症死亡率也在增加。好消息是，自1990年以来，经过年龄标准化的癌症死亡率实际上有所下降，尽管截至2019年只下降了15.22％（图1）。在此期间出现了数百种新的癌症治疗方法，但为什么存活率仍令人失望呢？正如世界卫生组织所说，早期诊断可以挽救生命并降低治疗成本。筛查的关键是非侵入性、可靠、可扩展的检测方法，可以在病理发生的早期阶段检测到癌症，以便进行快速治疗。最近的研究表明，可能有一个答案：细胞外囊泡（EVs）。这些微小的蛋白质、核酸和小分子的包裹物可被所有细胞（包括癌细胞）释放到体液中。

        近年来，对EV作为癌症诊断的兴趣呈指数增长，2022年发表在这个主题上的文章数量比2011年多150倍（来源：Web of Science）。考虑到EV具有将癌细胞衍生的蛋白质、RNA甚至DNA运输到易于非侵入性诊断的生物液体的潜力，该领域的诊断潜力是巨大的。然而，这些诊断测试开发中使用的许多方法不够纯净，可能无法扩展到诊断，更不用说大型筛查项目了。在本文中，我们将看一下EV癌症诊断领域内的三篇论文，每篇比较不同的EV分离纯化方法。

图1. 全球癌症死亡率变化。数据来自IHME Global Burden of Disease。死亡率的增加可能是由于全球人口的增加，而未经年龄标准化的癌症死亡率的增加可能是由于全球人口的老龄化。年龄标准化癌症死亡率的降低可能代表了诊断和治疗的改进。

        这三项比较EV分离纯化方法用于癌症诊断的研究之一是由Pang等人（2020）[1] 进行的，该研究来自前列腺癌诊断领域，目前的黄金诊断标准前列腺特异性抗原导致了许多不必要的活检 [2]。在Pang等人的研究中，他们旨在确定前列腺来源的血浆EV是否可以携带更具体的生物标志物。

        第二项研究是由Northrop-Albrecht等人（2022）[3]进行的，他们转向人类大便上清液EV诊断结肠癌。早期诊断结肠癌尤为重要，因为较晚的诊断将局部癌症的91％ 5年生存率降至仅为13％的远处扩散癌症的生存率。

        最后，Anastasi等人的研究（2020）[4]研究了一种多形性神经胶质母细胞瘤的小鼠模型，希望完善血清EV分离纯化技术，以便识别疾病进展的纵向标志物。

比较的EV分离方法背后的原理

        每项研究中比较的EV分离方法原理如图2所示。

        图2. 每个研究比较的细胞外囊泡（EV）纯化方法。

        沉淀法利用聚合物（例如聚乙二醇，常缩写为PEG）的聚合作用形成网状结构，较大的颗粒物和许多较小的颗粒物会被困住。然后可以将此网状物离心到管底。虽然此过程与特异性捕获EV无关，但经常被使用。

        qEV尺寸排阻柱使用尺寸排除色谱法根据其颗粒大小将EV与其他颗粒物分离。qEV有各种尺寸，可基于相同的原理分离从150 µL到100 mL的样品。qEV有两个系列：35 nm和70 nm系列，分别分离略有不同的EV范围。

        超滤将EV和任何其他较大的分子从起始样品浓缩到较小的体积中，与沉淀一样，不能真正单独分离EV。

        超速离心是EV领域的黄金标准。它使用逐渐增加的离心力将不同大小的颗粒沉淀，EV通常在或高于100,000 x g的离心下沉。虽然被认为是黄金标准，但由于纯度低、加工时间长以及EV受离心力损伤等问题，这种技术越来越不受青睐。

        那么，在癌症诊断的背景下，这些方法如何比较呢？

这些方法中，qEV可以分离出更纯的EVs 

        非EV组分的污染会覆盖真正的癌症EV生物标志物的信号，阻碍生物标志物的发现、验证和关键的早期诊断。对于与EV相关的蛋白生物标志物，这意味着必须去除可溶性蛋白和脂蛋白。而对于EV-RNA生物标志物，非EV RNA去除是关键。

qEV擅长去除蛋白质污染 

        EV分离物中可溶性蛋白质的污染程度通常由EV与蛋白质浓度的比率显示。Pang等人和Anastasi等人发现，与血浆和血清沉淀法相比，qEV的分离物具有更高的EV/蛋白质比率（图3A和C）。qEV 70nm略优于qEV 35nm，这是有道理的，因为35nm的尺寸截留较小，意味着可能会共同分离一些较大的蛋白复合物。Northrop-Albrecht等人发现，在粪便上清样品中，超速离心可能比其他技术提供略高的纯度，尽管超速离心的纯度变化非常大（图3B）。

图3. 使用不同方法分离出的细胞外囊泡（EVs）的纯度。

A和D：Pang等人通过商业沉淀试剂盒或qEV 35 nm或qEV 70 nm从前列腺癌患者或健康对照组的血浆中分离出EVs，确定了在蛋白质污染（A；EV标记物CD81、CD9和CD63相对强度除以分离物中的蛋白质µg）和脂蛋白污染（D；分离物中的ApoB强度）方面的纯度。统计分析采用One-way ANOVA 和 unspecified post-hoc test。

B和E：Northrop-Albrecht等人分析了用于结直肠癌诊断的人类大便中用不同方法分离出的EVs的纯度（以蛋白质污染（B；每µg蛋白质的颗粒数）和RNA污染（E；经蛋白酶K和RNase A处理后分离物中非EV RNA的降解）来表示）。UF=超滤；UC=超速离心；20k=20,000 x g沉淀；100k=100,000 x g沉淀。沉淀A和B代表两种不同的商业沉淀试剂盒。统计分析采用Kruskal-Wallis检验。

C和F：Anastasi等人通过商业沉淀试剂盒或qEV 70 nm从小鼠胶质母细胞瘤模型中分离出的EVs，确定了分离物中蛋白质去除百分比（C；通过分离物中的蛋白质浓度除以起始材料中的5,000 µg/µL计算）和污染物或“外泌体”蛋白质的相对富集（F；DAVID富集分析）。统计分析采用成对T检验（C）或Fisher精确检验，采用假阳性发现率（FDR）多重检验校正。

*p<0.05；** p<0.01；*** p<0.001

qEV可显著降低脂蛋白污染 

        由于他们分别使用了血浆和血清，Pang等人和Anastasi等人也对脂蛋白污染感兴趣。Pang等人发现，与沉淀法相比，qEV 70 nm的ApoB污染要低得多。qEV 35 nm显示出比qEV 70 nm 高的ApoB水平，可能是由于这些柱的较低尺寸截留。Anastasi等人使用蛋白质组学确定，虽然在qEV 70 nm的分离物中没有富集脂蛋白，但沉淀法分离物中富集了脂蛋白。这些数据表明，与常用的沉淀法相比，qEV 70 nm在去除脂蛋白污染方面更为优秀。

        qEV显著降低非EV RNA污染 在非EV RNA污染方面，qEV 70 nm也表现最佳，经过蛋白酶K和RNase A处理以降解非EV RNA后，qEV 70 nm的RNA谱与处理前仅有微小差异（图3E）。相反，超滤分离物却会分离出大量非EV RNA，这将掩盖EV RNA癌症生物标志物的鉴定或测量。

就可规模化而言，qEV是优秀的 

        要想使诊断测试成功，它必须是可规模化的。这意味着超速离心法因处理时间通常超过每个样品3小时而被立即排除。这还不包括任何生物标志物测量。超速离心法还需要大型、昂贵且（如果使用不当）非常危险的设备。超滤法具有可扩展性和自动化的潜力，但仅使用超滤法来分离EV以用于诊断的吸引力受到技术相对不纯的限制（图2E）。

        到目前为止，最快、最简单的方法是沉淀法，这导致该技术在诊断研究和试验中被使用。然而，它对EV的非选择性非常高，对污染物的去除效果差（图2A、C、D和F）。使用沉淀法在诊断研究中会阻碍发现过程吗？鉴于这些结果，这是一个明确的可能性。

        另一方面，qEV具有高度可扩展性，柱子有多种尺寸可适用于各种样本类型。此外，我们提供了高度自动化的EV分离纯化过程，使用qEV可以实现标准化的分离纯化，非常适合用于提供高质量的诊断测试。

图4.自动馏分收集器（AFC）与qEV相结合，可以实现精确、可定制和可重复的分离纯化。

        对于癌症诊断，应选择哪种分离方法？当然，我们是有偏见的，因为我们制造qEV尺寸排阻柱。但更多的科学证据支持了我们的观点，EV诊断研究人员正转向尺寸排除色谱，主要是因为相对于其他方法，它具有高度可扩展性和可重复性。使用qEV允许从临床样本中标准化、自动化地分离纯EV用于诊断目的。使用更纯的EV，通过自动化和优质产品带来的可重复性，使用qEV分离系统将确保您处于最佳位置，以识别有意义的生物标志物，以确保患者获得所需的早期诊断。

        事实上，我们的qEV已经被肿瘤诊断领域的研究人员在许多研究中使用。例如，Mercy Bioanalytics在其Mercy Halo™诊断测试中使用我们的qEV，如最近的一篇预印本所述，该预印本侧重于在人血浆中检测早期卵巢肿瘤。在非小细胞肺癌领域，David P. Carbone和Andreas Möller的小组使用qEV来追踪疾病轨迹和治疗反应。在乳腺癌方面，Sima Lev的团队使用qEV分离EV来分析疾病进展和治疗反应，Francesco Fabbri的团队使用qEV分离EV来识别早期诊断生物标志物，Clotilde Théry和Charlotte Proudhon的团队使用qEV柱识别转移性疾病的蛋白质生物标志物。在前列腺癌的研究中，Rienk Nieuwland的团队在阿姆斯特丹大学医疗中心的研究中使用了qEV，Karla C. Williams及其团队使用了qEV来鉴定潜在的血浆生物标志物STEAP1。这几个例子只是癌症研究人员使用qEV的文献中的一小部分。

        想了解更多吗？请联系我们，了解我们如何帮助您扩大和优化诊断通量（包括定制解决方案）。