用相机或手机拍照的时候，准确对焦是出好片的关键。这一点其实同样适用于酶标仪中的光学系统！本文将介绍酶标仪的焦距，以及这项设置对结果有何影响。 在酶标仪中，焦距（focal height）是指酶标仪的探测系统与微孔板中样品之间的距离。最佳对焦位置处于酶标仪能检测到样品最高信号强度的平面。如果测量时没有调好对焦，会对结果产生负面影响。

图1：某酶标仪的焦距曲线
 

不同型号的酶标仪

之间有何区别

不同制造商生产的酶标仪功能各异：有些不可调对焦，有些可能需要手动设置，有些可以自动调节。不能调节焦距的仪器通常是入门级设备，灵敏度有限。手动设置对焦的仪器需要反复试验，根据经验确定某项测定的最佳焦距。具有自动对焦功能的酶标仪可在测量前自动识别特定样品或一组样品的最佳焦距（图1）。只要加液体积和微孔板类型保持不变，就可以使用上一次测定设置好的焦距。BMG LABTECH的多功能酶标仪提供自动对焦选项，如CLARIOstar® Plus（图2），同时也支持根据需要手动设置对焦。

图2：BMG LABTECH的CLARIOstar® Plus提供多种不同的对焦设置选项

 

对焦设置

对信噪比的影响

受液体样品物理特性的影响，信号强度通常在样品液面稍下方达到最高。酶标仪会通过识别信号强度最高的平面来确定最佳焦距。提高对焦的高度会使光学焦点移到液面上方；降低对焦的高度会使光学焦点向微孔板底部方向移动。 在这两种情况下，测出的信号强度都会降低，而来自背景噪音的信号则保持不变，这会导致信噪比（图3）和assay window降低。

图3：信噪比受对焦设置的影响

 

在上图的例子中，设置不同焦距测量了100nM荧光团标准样品和空白样品，随后计算出相应的信噪比（S/B），并生成相对于焦距的曲线。自动调节得出的最佳焦距为9.3mm，对应的是本次对比实验中观察到的最佳信噪比值。当偏离确定的最佳焦距时，信噪比明显下降。 值得注意的是，不同应用的最佳焦距取决于微孔板类型、加液体积和分析类型。比如在测量贴壁细胞样本时，孔底部的信号强度最高。 

对焦设置对数据变异

有何影响？

对焦设置不仅会影响测出的信号强度，还会影响数据变异（图4），具体来说，设置不好会使重复样品间的差异（%CV）增大，从而降低检测结果的质量。

图4：对焦设置对数据变异的影响

对焦设置也会影响数据点的变异性。为了展示这一点，我们计算了在不同焦距下测量三等份100nM荧光团标准样品的%CV值。如图3所示，在酶标仪确定的最佳焦距9.3处测量时，%CV值最低。在偏离最佳焦距时，变异系数增大。当焦距低于最佳值时，%CV值的增加相对较小，但当焦距高于最佳值时，%CV值会增加3%之多。 

对焦取决于

加液体积

 可以看出，准确调整酶标仪的焦距是获得最佳结果的关键，但前提是必须将微孔板上各孔的加液体积差异保持在最小范围内。 由于最佳焦距是根据一个样品孔的填充体积确定的，因此，无论是无意中因移液错误还是有意中因移液体积不同而造成的差异，都会改变结果。正如下面的示例（图5）所展现的，即使各孔之间的体积相差几微升，也会导致测出信号强度的显著变化。

图5：微孔板中不同加液体积对荧光信号的影响

 

在此示例中，我们在样品孔中移入了不同体积（10至30μL）的10nM荧光团标准液。在样品体积为15μL的孔中进行对焦调节，之后使用所获得的设置对所有样品进行测量，测量数据相对于15μL孔中的数据进行归一化处理。如图5所示，在加液水平较低或较高的孔上使用15μL的最佳焦距会导致明显的偏差。即使样品量只有2.5μL的微小差异，也会导致20%的信号强度偏差。在某些情况下，这甚至会导致信号增加，因为样品体积较高的孔中含有的分析物总量更高。 

转载自：BMG LABTECH


 

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